UABDivulga - Barcelona recerca i innovació

Diverses característiques de les proteïnes cel·lulars, que van des de l'activitat enzimàtica, a la localització intracel·lular o la capacitat d'interaccionar amb altres molècules, entre d'altres, són regulades mitjançant l'addició o eliminació de grups fosfat d'alguns dels aminoàcids que les componen. L'estat de fosforilació d'una proteïna és el resultat del balanç de les activitats entre les proteïnes fosforiladores (quinases) i desfosforiladores (fosfatases). La desregulació en qualsevol d'aquestes activitats, presents en tots els organismes eucariotes, pot desencadenar importants alteracions en la fisiologia cel·lular, podent donar lloc a greus malalties. Un dels mecanismes que controlen a les proteïnes quinases i fosfatases és el de la seva unió a altres proteïnes, denominades subunitats reguladores, que modulen la seva activitat, especificitat de substrat, localització, etc.

En el laboratori estem interessats en la regulació de Glc7, una proteïna fosfatasa de tipus 1 del llevat S. cerevisiae, implicada en múltiples i importants funcions essencials per a la viabilitat cel·lular, sent el manteniment de la homeòstasis iònica un d'ells. És, precisament, aquesta diversitat de funcions de Glc7 el que fa que es disposi de múltiples subunidades reguladores (almenys 18), encara que són més de cent les proteïnes amb les que s'ha detectat, per un o un altre mètode, que són capaços d'unir-se a aquesta fosfatasa. La major part de les subunitats reguladores de Glc7 posseeixen una seqüència aminoacídica característica [(R/K)(V/I)X(F/W)] mitjançant la qual té lloc la unió a la fosfatasa. Amb la finalitat d'identificar les funcions cel·lulars en les quals es troba implicada cada subunitat reguladora de Glc7, estem estudiant els efectes que la falta de cadascuna d'aquestes provoca.

Dels resultats preliminars ens van cridar l'atenció els concernents a Ref2, una subunitat exclusivament implicada en diversos processos relacionats amb el processament i maduració de diversos tipus de RNA. Els nostres resultats indicaven que les cèl·lules amb falta de Ref2 presentaven un creixement molt lent tant en presència de cations de calci (CaCl₂), sodi (NaCl) o liti (LiCl) com a pH alcalí. Aquestes sensibilitats resulten simptomàtiques de defectes en la homeòstasis iònica. De fet, les cèl·lules amb falta de Ref2 presenten un creixement més lent que les cèl·lules wild type en condicions limitants de potassi, així com una major sensibilitat a diversos cations orgànics tòxics, com el TMA (tetrametilamonio), la higromicina B o l'espermina. Fets, tots ells, no atribuïbles a un defecte en el processament del RNA.

A més, els defectes descrits, conseqüència de la falta de la proteïna Ref2, són comparables a aquells observats en cèl·lules que expressen una proteïna Ref2 idèntica a la nadiva exceptuant la mutació d'un aminoàcid del motiu (R/K)(V/I)X(F/W), la qual cosa li impedeix la seva interacció (i regulació) amb Glc7.

La hipersensibilitat al liti es devia a un defecte en la destoxificació del catió, procés realitzat per la proteïna ATPasa Ena1. Aquest fet pot ser explicat, almenys en part, pel fet que en absència de Ref2, l'expressió del gen ENA1 no s'indueix com ho faria en les cèl·lules wild type en presència de liti i uns altres estressos. Per tant, impliquem a Ref2 en la regulació de l'expressió de ENA1.

Determinem que l'alta sensibilitat a calci és explicada per una major activitat d'una proteïna fosfatasa depenent de calci, a causa d'una concentració anormalment elevada de calci intracel·lular en els mutants ref2. Un compartiment cel·lular important en la homeòstasis del calci és el vacúol, la disfunció del qual va freqüentment acompanyada de defectes en la seva morfologia. La tinció de la membrana vacuolar de les cèl·lules ref2 va manifestar que la falta d'aquesta subunitat reguladora provoca importants defectes en la morfologia vacuolar (veure figura).

A més, hem demostrat que en cèl·lules portadores de diverses mutacions en les quals es produeix un deficient processament del RNA, la homeòstasis catiònica no es veu en absolut afectada.

Tot això ens permet determinar que la proteïna Ref2, mitjançant la seva unió a la fosfatasa Glc7, intervé en funcions relacionades amb el manteniment de la homeòstasis iònica per les quals no s'havia identificat encara la subunitat reguladora responsable. Per tant, Ref2 representa un exemple de subunitat reguladora de Glc7 amb diverses funcions cel·lulars.